贺倩倩 1 ， 李耀耀 1 ， 曹毅 2 ， 杨晓红 2 ， 吴蓓玲 2 ( 1． 浙江中医药大学; 2． 浙江中医药大学附属第一医院)
摘 要: 目的: 研究祛斑汤对 HaCat 细胞、 黑素细胞的抑制作用及对 SCF/C － kit 蛋白表达水平的影响， 探讨 SCF/C － kit 信号通路与黄褐斑发病机制的相关性。方法: MTT 法观察 0、 5、 15、 25、 50、 100 mg/mL 浓度祛斑汤对 HaCat 细胞、 黑素细胞的抑制情况， 选取最佳抑制浓度; 根据最佳抑制浓度， 将 Hacat 细胞分为 1640 培养基组、 0. 03 J/cm 2 UVB 照射组、 15 mg/mL 祛斑汤组、 0． 03 J/cm 2 UVB 照射 +15 mg/mL 祛斑汤组， 黑素细胞分为 MelM －2 培养基组、 0． 03 J/cm 2 UVB 照射组、 25 mg/mL 祛斑汤组、 0． 03 J/cm 2 UVB 照射 +25 mg/mL 祛斑汤组; Western blot 法检测各组 Hacat 细胞 SCF 蛋白表达水平， 各组黑素细胞的 C － kit 受体蛋白表达水平。结果: 祛斑汤呈浓度依赖 性抑制 Hacat 细胞/黑素细胞增殖， 15 mg/mL 时对 Hacat 细胞的抑制效应达到峰值( P ＜0． 01) ， 25 mg/mL 时对黑 素细胞的抑制效应达到峰值( P ＜0． 01) ; 祛斑汤抑制 Hacat 细胞 SCF 蛋白的表达和黑素细胞 C － kit 受体蛋白的 表达， 并下调 UVB 对 HaCat 细胞、 黑素细胞 SCF、 C － kit 蛋白表达的促进作用。结论: 祛斑汤能有效抑制 Hacat 细 胞、 黑素细胞的增殖， 可能与抑制 SCF/C － kit 信号途径的 SCF、 C － kit 蛋白表达有关。
关键词: 祛斑汤; 黄褐斑; HaCat 细胞; 黑素细胞; SCF/C － kit 信号途径
黄褐斑( Melasma) 是一种获得性色素沉着皮肤病， 临 床以面部对称性黄褐色色素沉着为主要表现， 多见于中青年女性， 易伴有不同程度的月经失调、 烦躁易怒、 失眠等症 状， 给患者带来较大的生活和精神压力。近年来， 本科自拟 祛斑汤治疗黄褐斑取得良好的临床疗效。但是黄褐斑的发 病机理十分复杂， 真正的发病原因尚不十分清楚， 多数学者 认为， 黄褐斑皮肤色素加深主要是由于皮肤中的黑素颗粒 增多引起的 ［1 ］ ， 干细胞因子( stem cell factor SCF) 和 C － kit 受体是其中一对重要的细胞因子， 在黑素代谢中起关键作 用 ［2 －4 ］ 。研究证明， UVB 照射可以引起皮肤色素沉着， 一 定剂量的 UVB 照射可以促进黑素细胞增殖， 增加黑素合 成 ［5 ］ 。本研究拟通过观察 UVB、 祛斑汤处理下 Hacat 细胞/ 黑素细胞 SCF 和 C － kit 蛋白的表达情况， 探索祛斑汤治疗 黄褐斑的可能机制。
1 仪器和试剂
1． 1 仪器
超净工作台( 上海净化， 型号: SW － CJ － 2F) 、 CO2 培 养箱( Thermo Forma， 型号: 3111) 、 倒置显微镜( COIC， 型号: XJP －2/3) 、 超纯水仪( Thermo Forma， 型号: EASYpure Ｒo- Di) 、 电泳仪及电泳槽( BIO － ＲAD， 型号: PowerPac 系列) 、 凝胶成像系统( BIO － ＲAD， 型号: Gel DocTM XＲ) 、 低温高 速离心机( Thermo Forma) 、 低温冰箱( SANYO) 、 电子天平 ( Mettler Toledo， 型号: AL204/01) ， 液氮罐( Thermo Forma) 、 细胞培养瓶( Corning) 、 96 孔培养板( Corning) 等。
1． 2 试剂
祛斑汤由柴胡12 g， 当归12 g， 菟丝子15 g， 益母草30 g， 川芎12 g， 丹参30 g， 白茯苓15 g， 白芷6 g， 白僵蚕 9 g， 枸杞 子15 g， 制首乌30 g， 桑白皮12 g 组成， 所需中药成分由浙江 省中医院中药制剂室提供。兔抗人 SCF 抗体( 美国 Pepro- Tech 公司) 、 兔抗人多克隆 β － actin 抗体( 博奥森生物有限 公司) 、 兔抗人 C － kit 抗体( 上海优宁维生物科技有限公 司) 、 生物素标记数二抗( 鼠抗兔 IgG) ( 杭州达文生物有限公 司) 、 1640( hyclone) 、 胎牛血清( 美国 Invitrogen 公司) 、 0．25% 胰酶/EDTA( 美国 Invitrogen 公司) 、 四甲基偶氮唑蓝( MTT) ( 美国 Sigma 公司) 、 BCA 蛋白定量试剂盒( 普利莱基因技术 有限公司) 、 ECL 显色试剂盒( Biological Industries) 。
2 试验方法
2． 1 Hacat 细胞/黑素细胞的培养和传代
2． 1． 1 Hacat 细胞的培养和传代 Hacat 细胞的培养液为 含 10%胎牛血清的高糖 DMEM 培养液， 将细胞( 本科室长 期保存) 培养于 37 ℃、 5% CO2 恒温饱和湿度培养箱， 显微 镜下观察细胞生长情况， 是否污染， 是否有细胞悬浮等; 待 细胞融合约瓶底 85% ～95%状态时， 吸去瓶内培养液， PBS 洗涤两次， 加入胰酶适量， 37 ℃孵育 5 min， 吸掉胰酶， 加入 2 mL 培养液终止消化， 反复吹打成使贴壁细胞悬浮于培养 基中， 然后转移至 15 mL 离心管， 800 r/min， 离心 5 min， 弃 上清， 加培养液， 反复吹打， 使细胞悬浮均匀， 以 1 ∶ 3 的比 例接种到培养瓶中。温饱和湿度培养箱。
2． 1． 2 黑素细胞的培养和传代 黑素细胞购自美国 scien- cell 公司， 培养液为含有 2． 5% 胎牛血清的 MelM － 2 培养 液， 余处理方式同 Hacat 细胞。
2． 2 Hacat 细胞、 黑素细胞的 UVB 处理 将对应组细胞用 30mJ/cm 2 UVB 预照射 30 min 后再用 不同浓度祛斑汤提取液处理。
2． 3 药物的配制和贮存
祛斑汤: 取祛斑汤中药成分加相当于药材量 10 倍的蒸 馏水浸泡 2 h， 第一次回流提取 1． 5 h， 滤过后药渣再加 10 倍量水继续提取 1 h， 合并 2 次滤液， 于水浴上浓缩定容至 每 mL 相当于原方生药材 1 g 的药液， 离心去渣， －20°冰箱 低温保存。
2． 4 检测 Hacat 细胞、 黑素细胞增殖
2． 4． 1 Hacat 细胞 先检测能使 Hacat 细胞增殖的祛斑汤 的最佳浓度。将 Hacat 细胞以1 ×10 5 /mL 的密度种植于96 孔板， 每孔 100 μL， 分为 0、 5、 10、 25、 50、 100 ng·mL －1 5 组， 每组6 个复孔， 置于5%CO 2 、 37 ℃恒温培养箱中培养24 h， 待细胞铺满培养孔底部60% ～70%时， 吸除培养液， 用 PBS 冲洗两次， 分别加入用 PBS 配成的 0、 5、 10、 25、 50、 100 ng· mL －1 的祛斑汤， 继续培养 24 h 后吸除培养液， 每孔加入 20 μL 用 PBS 配成的 MTT( 5 mg·mL －1 ) ， 放置于 5% CO 2 、 37 ℃恒温培养箱中3 h， 去培养液， 加入150( lDMSO 后震荡10 min， 置于酶标仪 570 nm 读取吸光度值， 比较各组 OD 值， 选取最佳浓度。
2． 4． 2 黑素细胞 黑素细胞的增殖检测同 Hacat 细胞。
2． 5 Hacat 细胞、 黑素细胞的 SCF/C － kit 蛋白检测 设立 DMEM 培养基组、 0． 03 J/cm 2 UVB 照射组、 15 mg/ mL 祛斑汤组、 0． 03 J/cm 2 UVB 照射 +15 mg/mL 祛斑汤组， 取对数生长期 Hacat 细胞， 待细胞铺满培养瓶 70%时， 根据 分组对其进行处理， 继续培养24 h。吸除培养液， 用 PBS 冲 洗两次; 细胞刮刷刮瓶底细胞， 然后用移液器将细胞碎片转 移至 1． 5 mL EP 管中， 4 ℃、 12 000 r/min、 5 min 离心， 弃上 清; 每个 EP 管加入 300 μL ＲIPA 细胞裂解液， 冰上均匀裂 解 30 min; 裂解完成后用 BCA 法测定蛋白浓度。根据所测 蛋白浓度， 计算 40 μg 溶液蛋白的体积为上样量。将 40 μg 样品蛋白 SDS － PAGE 电泳后转印至 PVDF 膜上， 封闭后加 入相应的一抗( 用 5% 脱脂奶粉封闭液稀释过的 SCF、 β － actin 抗体， 稀释度为 1 ∶ 1000) ， 4 ℃过夜孵育。一抗反应结 束后， 用 1 × TBST 在摇床上室温洗 3 次， 每次 10 min; 再加 入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗 ( 稀释度为 1 ∶ 1000) ， 室温孵育 2 h， 二抗孵育结束后用 1 × TBST 在摇床 上室温洗 3 次， 每次 10 min; 最后用 ECL 试剂盒显影拍照。 再用同样的方法检测黑素细胞的 C － kit 蛋白表达。
2． 6 数据统计
计量资料以 珋 x ± s 表示; 使用 SPSS 17． 0 软件进行统计， 组间比较采用 t 检验， 相关性采用 Pearson 分析， P≤0． 05 为 差异有统计学意义; 采用 SDS 软件、 Biorad 软件、 GraphPad Prism 5． 0 进行数据图像处理。
3 结果
3． 1 不同浓度祛斑汤对 Hacat 细胞增殖的影响 MTT 法检测不同浓度祛斑汤对 Hacat 细胞增殖的影响 结果显示， 对照组 OD 值最高， 其他不同浓度祛斑汤 OD 值 均低于对照组; 5 mg/mL 的祛斑汤即可抑制 HaCat 细胞增 殖， 15 mg/mL 祛斑汤的抑制效应基本达到最大值( P ＜ 0． 01) ， 当浓度 ＞15 mg/mL 时， 显微镜下可见 Hacat 细胞坏 死、 脱落， 浓度越高， 细胞坏死脱落越明显。见图 1。
祛斑汤组黑素细胞 C － kit 蛋白表达情况， 与培养基组相 比， UVB 能促进黑素细胞 C － kit 蛋白表达， 祛斑汤明显抑 制细胞 C － kit 蛋白表达， 同时抑制 UVB 促进黑素细胞 C － kit 蛋白表达能力。本实验重复 3 次， 结果相似。见图 4。
4 讨论
黄褐斑， 中医认为与肝、 脾、 肾三脏密切相关， 主要病机 为气滞血瘀、 肝肾不足、 脾虚湿停等。肝主藏血、 疏泄调达， 疏泄功能失常， 气机不畅， 郁而气滞， 气滞则血瘀; 肝藏血、 肾藏精， 肾阴不足， 精血亏虚， 虚火上炎， 火燥熏蒸颜面成黑 斑; 胃主受纳， 脾主运化， 脾胃虚弱， 水谷精微化生失常， 水 饮停滞， 气血不和， 不能上荣于皮肤， 发为黄褐斑 。《外科 证治全书·面部证治·面尘》 云 : “面色如尘垢， 日久煤黑， 形枯不泽。或起大小黑斑， 与面肤相平。由忧思抑郁， 血弱 不华。外用玉容散， ……内宜疏胆气兼清肝， 加味归脾汤送 六味地黄丸主之……” 。
本科观察了祛斑汤联合还原型谷胱甘肽静滴治疗 135 例黄褐斑患者， 有效率高达 84． 5%， 明显高于口服维生素 E、 维生素 C、 胱氨酸的对照组 ［6 ］ 。祛斑汤由柴胡 12 g， 当归 12 g， 菟丝子 15 g， 益母草30 g， 川芎12 g， 丹参30 g， 白茯苓 15 g， 白芷6 g， 白僵蚕9 g， 枸杞子15 g， 制首乌30 g， 桑白皮 12 g 组成， 临床上用于黄褐斑治疗， 疗效明确。本方柴胡疏 肝理气， 川芎、 当归、 丹参、 益母草养血活血， 白茯苓、 桑白 皮、 白芷、 白僵蚕健脾理湿、 祛风利水， 菟丝子、 枸杞子、 制首 乌补益肝肾， 滋阴养血， 全方共奏疏肝解郁， 补肝益肾， 调和 气血， 活血化瘀之功。陈仁康发现化瘀消斑汤配合外用洗 面方治疗黄褐斑有明显效果， 有效率达 85% ［7 ］ 。杜柯 ［8 ］ 的 研究指出柴胡内含有丰富的柴胡多糖， 具有良好的抗衰老、 抗氧化作用; 张建华等 ［9 －10 ］ 研究表明白芷， 白茯苓、 当归、 川芎、 白僵蚕的萃取物对酪氨酸酶有不同的抑制作用; 应军 等 ［11 ］ 指出丹参提取液能提高机体抗氧化能力， 抑制 TYＲ 活性， 减少黑色素的合成以及改善机体的血液流变学， 达到 防治黄褐斑的功效。
中医药治疗黄褐斑在临床上取得了一定的疗效， 但也 存在一些难题。国内对于中医药治疗黄褐斑的研究多局限 在病案分析、 专家经验报告等回顾性研究， 缺乏对其病因病 机的前瞻性研究。西医认为人类皮肤色素沉着过程主要为 成熟的黑素小体合成黑素， 黑素小体向树突远端转移、 传递 至邻近角质形成细胞， 然后在角质形成细胞内分布和降解。 在这一过程中， 黑素颗粒合成增多、 黑素颗粒从黑素小体向 邻近角质形成细胞转运减少及角质形成细胞新陈代谢下降 都有可能引起皮肤中黑素颗粒的增多， 但其真正的机制尚 未明确。Hachiya 等发现经 UVB 照射后， 培养的角质形成 细胞和黑素细胞的 SCF 和 C － kit 受体的基因水平和蛋白 水平量均显著增加; 阻断 SCF/KIT 途径后， 紫外线照射不 再引起豚鼠皮肤黑素细胞增加。潘建英等 ［5 ］ 实验研究发 现 0 ～0． 06 J/cm 2 UVB 能激活酪氨酸酶和促进黑素细胞的 黑素合成。这些实验结果都说明了 SCF/KIT 途径在紫外 线引起黑素细胞增生、 色素沉着中的关键作用。
本实验通过研究祛斑汤对 HaCat 细胞/黑素细胞的抑 制作用及对 SCF/C － kit 蛋白表达水平的影响， 发现祛斑汤 呈 浓度依赖性抑制Hacat细胞 /黑素细胞增殖， 15mg /mL 时对 Hacat 细胞的抑制效应达到峰值( P ＜ 0． 01) ， 25 mg/ mL 时对黑素细胞的抑制效应达到峰值( P ＜0． 01) ， 且抑制 Hacat 细胞 SCF 蛋白的表达和黑素细胞 C － kit 受体蛋白的 表达， 并下调 UVB 对 HaCat 细胞/黑素细胞 SCF、 C － kit 蛋 白表达的促进作用。由此， 笔者推测祛斑汤治疗黄褐斑的 机制可能与 SCF/C － kit 信号通路有关， 本实验为其临床治 疗黄褐斑提供了有力的实验依据。
参考文献
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