作者：王津存，黄远桂，温晓妮，王卫东，夏峰，王小木，杨方,吴松笛
【关键词】电针
Effectofelectroacupunctureappliedatacupointonneurogenesisinhippocampaldentategyrusandbehaviorofratswithlithiumpilocarpineinducedstatusepilepticus
WANGJinCun，HUANGYuanGui，WENXiaoNi，WANGWeiDong，XIAFeng，WANGXiaoMu，YANGFang，WUSongDi
DepartmentofNeurology,Xijing Hospital，FourthMilitaryMedicalUniversity，Xian710033,China
【Abstract】AIM:ToinvestigatetheeffectofelectroacupunctureappliedatBaihuiacupointonthebehaviorandelectroencephalogramoftheratswithlithiumpilocarpineinducedstatusepilepticus（SE）andprovidesomeexperimentalbasisfortreatingtheseizureswithacupointstimulation.METHODS:AdultmaleSDratsweresubjectedtolithiumpilocarpineinducedSEmodel.Byusingbromodeoxyuridine（BrdU）labelingmethodandimmunohistochemistry,wecomparedtheproliferationrateofneuralprecursorcellsinthedentategyrusbetweentheinterventiongroupandthecontrolgroupat7,14and42dafterSE.Thealterationofbehaviorswasobserved.RESULTS:ElectroacupunctureappliedatBaihuiacupointsignificantlyincreasedthenumberofBrdUlabeledcellsinthedentategyrus7and14dafterSEwasinduced（P<0.01）,butdidnotinfluencethenumberofBrdUlabeledcellsinthe42depilepticlivingrats（P>0.05）.Spontaneousrecurrentseizures（SRSs）happenedlessintheinterventiongroup（42dafterepilepticseizure）thanincontrolgroups（P<0.05）.CONCLUSION:ElectroacupunctureappliedatBaihuiacupointcanefficientlyincreasetheproliferationofneuralprecursorcellsinthedentategyrusafterepilepticseizures,indicatingthatelectroacupunctureatBaihuiacupoint,tosomeextent,participatesinthealterationofneuralplasticityinhippocampusinepilepticrats.
【Keywords】electroacupuncturestimulation;Baihuiacupoint;neurogenesis;epilepsy;lithiumpilocarpine
【摘要】目的：观察电针刺激百会穴对锂匹罗卡品诱导致痫大鼠海马齿状回神经发生及行为的影响，为进一步揭示穴位刺激治疗癫痫的机制提供基本的实验依据.方法：选用锂匹罗卡品诱导致痫成年大鼠模型，采用BrdU标记分裂细胞及免疫组织化学方法比较致痫后7,14,42d时电针刺激穴位干预致痫组大鼠与相应对照组大鼠之间海马齿状回神经前体细胞的增殖速度，并同时观察动物行为学改变.结果：电针穴位刺激后，明显促进了大鼠致痫后7d,14d时齿状回的神经发生水平，BrdU免疫阳性细胞数目较相应对照组明显增加（P<0.01），而致痫后第42日时两组大鼠齿状回BrdU免疫阳性细胞数目无显著性差异（P＞0.05）.同时，电针穴位刺激干预组大鼠（存活42d大鼠）平均每周SRSs次数明显少于电针刺激对照组和无刺激对照组大鼠.结论：电针刺激百会穴可促进癫痫后海马齿状回神经发生水平的改变，即电针刺激百会穴在一定的程度上参与了癫痫后海马的神经可塑性变化.
【关键词】电针刺激;百会穴;神经发生;癫痫;锂匹罗卡品
近年来有关成年脑组织神经发生的研究发现,缺血、缺氧、外伤、癫痫等许多原因所致的脑损伤均可诱导成年海马齿状回神经元再生的增加,成年哺乳动物脑内神经元再生相关机制的研究已成为神经科学领域内的一个最激动人心的课题［1-3］.国内、外相关研究结果表明癫痫后的海马齿状回的神经发生即神经可朔性的改变与癫痫的发生和发作密切相关，而祖国传统医学的理论和实践也显示穴位刺激具有明显的抑制癫痫发生与发作的作用［4-5］.因此，在目前我们对穴位刺激治疗癫痫基础研究领域尚缺乏深入实验研究的前提下，探讨电针穴位刺激是否会对海马齿状回神经发生产生影响无疑是一个值得我们关注的内容.本研究中，我们选用锂匹罗卡品诱导致痫大鼠模型，对致痫大鼠电针刺激百会穴后海马齿状回的神经发生和行为学改变进行了初步观察和研究，旨在为进一步揭示穴位刺激治疗癫痫的机制提供基本的实验依据.
1材料和方法
1.1材料成年雄性SD大鼠，由第四军医大学动物实验中心提供，体质量200～250g.饲养于12～12h光暗环境，给予标准饮食.选取SE发作程度依据OnoJ分级标准Ⅳ级（含Ⅳ级）以上存活大鼠随机分为电针穴位刺激干预组（n=12）,电针刺激对照干预组（n=12），各干预组大鼠又分别随机分为致痫后7，14，42d3个时间组（每个时间点4只大鼠）.参考相关文献［6-8］锂匹罗卡品癫痫模型制作予造模大鼠腹腔注射氯化锂（3meq/kg,中国医药集团上海试剂公司）,18h后腹腔注射盐酸匹罗卡品（30mg/kg,Sigma公司），所有注射匹罗卡品大鼠均于数分钟内出现强直阵孪性发作癫痫持续状态（SE），60min后腹腔注射地西泮注射液（4mg/kg）终止发作，以降低死亡率.
1.2.1分组电针穴位刺激干预、BrdU给药方法及脑片标本制备电针穴位刺激组大鼠（电针刺激致痫大鼠百会穴）和电针刺激对照组大鼠（电针刺激致痫大鼠百会穴相临的非穴位处）均采用G6805型电针治疗仪于致痫后第2日开始进行电针刺激干预，共刺激3d.电针刺激参数为：频率为50Hz,电流强度20mA,时间20min，2次/d.不同时间点各组大鼠于相应时间点前1d以BrdU50mg/kg（BoehringerMannheim）腹腔注射给药2次，2h间隔/次，24h后予戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉，经升主动脉灌注生理盐水100mL，40g/L多聚甲醛液（pH7.4）500mL后，断头取脑，将脑组织置入40g/L多聚甲醛后固定过夜，200g/L蔗糖4℃沉底，选择海马部位应用冰冻切片机冠状位连续切片，每隔150μm取脑片1张，脑片厚30μm，收集于0.01mol/LKPBS中.
1.2.2免疫细胞化学参考有关文献［9］对脑片进行染色，具体步骤如下：取切片入500g/L甲酰胺（Sigma）/2×SSC中65℃2h，2×SSC漂洗后，入2mmol/LHCl中37℃30min，0.01mol/L硼酸液中和10min，浸入含0.3g/LTritonX100的0.01mol/LKPBS30min，之后入小鼠抗BrdU抗体（1∶1000，Sigma）4℃孵育48h，再依次入生物素化的羊抗小鼠IgG（1∶500,Sigma）室温2h、生物素卵白素HRP复合物（1:500,Sigma）室温2h，最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺法呈色.然后常规贴片、干燥、脱水、透明、封片.光镜观察.对照染色用血清稀释液代替第一抗体.
1.2.3行为学观察记录各致痫大鼠首次发作的行为学改变、首次癫痫发作平均潜伏期、注射地西泮前强直阵孪发作次数和持续时间,以及静默期的长短.此后，每天观察动物的行为学变化4h，记录存活42d大鼠静默期后出现的OnoJ分级标准［10］Ⅰ～Ⅲ级的自发反复发作（SRSs）次数.同时在400倍光镜下观察各干预组不同时间点大鼠齿状回颗粒细胞层（GCL）、亚颗粒增生带（SGZ，GCL与门区之间约2个细胞体厚的一层［11］）及门区BrdU阳性细胞数并进行比较，每只大鼠随机选取4~5个非连续的脑片进行计数.统计学处理：实验结果以x±s表示，使用SPSS11.0软件包行方差分析,P<0.05认为有统计学差异.
2.1行为学改变匹罗卡品注射后5min大鼠开始出现烦躁不安、跑动、凝视、站立、点头、咀嚼样动作、湿狗样抖动等表现.约30min左右出现面肌抽动、前肢震颤、姿势失衡、跌倒，继之发生全身强直阵挛抽搐，持续1~2min.发作间期动物呈疲劳状态.注射地西泮后，大鼠逐渐停止癫痫发作，经过5～20d的静默期后，进入慢性期的各干预组致痫大鼠均观察到OnoJ分级标准Ⅰ～Ⅲ级的自发反复发作（SRSs）.各干预组致痫大鼠首次癫痫发作平均潜伏期、注射地西泮前强直阵孪发作次数和平均持续时间无显著性差异（表1，P＞0.05）.电针穴位刺激干预组大鼠（存活42d大鼠）平均每周SRSs次数明显少于电针刺激对照组和无刺激对照组大鼠（表1，P<0.05）.
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